KY体育官方网站本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及生物制品的制作方法、生物制品和应用。

　　材料表面理化特性(包括表面拓扑结构和化学组成)可调控细胞黏附、细胞增殖和细胞分化等行为；因此，制备具有特殊表面拓扑结构和化学组成的材料或工具不仅可以促进材料科学的发展，也可为细胞生物学研究提供多样化的材料基础；同时，材料表面理化特性对细胞行为调控的研究也可为材料表面的设计与制备提供理论指导，使材料表面达到特异性调控细胞行为的目的。

　　用于细胞生物学研究的表面拓扑结构主要包括纳米管、纳米纤维、纳米沟槽、纳米柱和纳米孔、反蛋白石结构等。上述微纳表面拓扑结构的制备方法可分为“由上而下(top-down)”和“由下而上(bottomup)”两类。由上而下方法包括光刻蚀技术、电化学阳极氧化技术、电子束蚀刻技术与反应离子蚀刻技术等，其中，光刻蚀技术是制备精细表面微纳结构的有效方法，但是其制备过程耗时且昂贵，对仪器依赖性高，因此无法在生物领域被大量使用。

　　分子自组装技术是由下而上方法中的典型一种。在自然界中，如蛋白石结构、动物与植物体内的复杂结构等，都是分子自组装的最佳案例。纳米颗粒自组装技术在光学及相关领域有较多报道，但利用此技术制备生物材料的报道并不多。目前尚无一种有效的方式能够快速且大量(高通量)制备具有不同化学组成以及表面拓扑结构的多级微纳米结构，并将其应用到生物细胞培养中。

　　本发明的第一个目的在于提供一种生物制品的制作方法，该制作方法可利用颗粒自组装技术在培养板内高通量的制备出具有不同化学组成和表面拓扑结构的多级微纳米结构，且该生物制品可直接用于生物细胞培养。

　　本发明的第二个目的在于提供一种生物制品，采用上述生物制品的制作方法制得。

　　(b)将所述微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和任选地水分别注入到所述培养板的同一培养孔内混合，形成微纳颗粒混合液；

　　(c)将含有微纳颗粒混合液的培养板进行干燥，使培养孔内排列出多级微纳结构；

　　进一步的，在上述技术方案基础之上，步骤(a)中，所述微米颗粒溶液中的微米颗粒为无机微米颗粒和/或有机微米颗粒，优选为无机微米颗粒；

　　优选地，所述无机微米颗粒包括sio2微米颗粒、zno微米颗粒、tio2微米颗粒或mno2微米颗粒中的任意一种或至少两种的组合；

　　优选地，所述有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒包括聚甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒和/或聚苯乙烯或其衍生物纳米颗粒。

　　进一步的，在上述技术方案基础之上，步骤(a)中，所述微米颗粒溶液中微米颗粒的质量分数为5-15％；

　　和/或，步骤(a)中，所述有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的质量分数为5-15％；

　　和/或，步骤(a)中，所述有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的粒径为50-800nm。

　　进一步的，在上述技术方案基础之上，步骤(b)中，所述微米颗粒溶液、纳米颗粒溶液和任选地水分别通过全自动分注系统注入到所述培养板的同一培养孔内；

　　和/或，步骤(b)中，式1：v1＝a*s/(w1/ρ1/v1)，其中，v1为同一培养孔内所需加入的微米颗粒溶液的体积，a为0.7-0.9，s为培养孔的底面积，w1为微米颗粒溶液中微米颗粒的质量分数，ρ1为微米颗粒溶液中微米颗粒的密度，v1为微米颗粒溶液中单个微米颗粒的体积；

　　式2：v2＝(1-a)*s/(w2/ρ2/v2)，其中，v2为同一培养孔内所需加入的有机纳米颗粒溶液的体积，a为0.7-0.9，s为培养孔的底面积，w2为有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的质量分数，ρ2为有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的密度，v2为有机纳米颗粒溶液中单个有机纳米颗粒的体积。

　　进一步的，在上述技术方案基础之上，步骤(b)中，采用蛋白质溶液或聚多巴胺溶液对所述培养板的培养孔进行表面处理后，对所述培养板进行任选地等离子体处理，再将所述微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和任选地水分别注入到所述培养板的同一培养孔内；

　　优选地，步骤(b)中，所述表面处理包括将蛋白质溶液和/或聚多巴胺溶液加入到培养孔内，室温静置30-60min的步骤；

　　优选地，步骤(b)中，所述蛋白质溶液和/或聚多巴胺溶液的质量分数为0.01-1％；

　　优选地，步骤(b)中，所述等离子体处理时所采用的气体包括空气、氧气或氩气中的任意一种或至少两种的组合；

　　优选地，步骤(b)中，所述等离子体处理时的时间为0.5-10min，功率为20-300w。

　　进一步的，在上述技术方案基础之上，步骤(c)中，所述干燥的温度为20-60℃，所述干燥的时间为12-48h。

　　进一步的，在上述技术方案基础之上，步骤(d)中，将培养孔内的多级微纳结构依次进行加热固定和有机溶剂固定。

　　进一步的，在上述技术方案基础之上，步骤(d)中，所述加热固定包括将形成有多级微纳结构的培养板于90-99℃下加热1-24h的步骤；

　　优选地，步骤(d)中，所述有机溶剂固定包括以下步骤：将有机溶剂加入到培养孔中，与加热固定后的多级微纳结构混合1-5s后排出；

　　优选地，步骤(d)中，在所述有机溶剂固定中采用的有机溶剂为甲苯和乙醇的混合溶液，其中，甲苯和乙醇的体积比为1:(0.5-4)；

　　优选地，步骤(d)中，将培养孔内的多级微纳结构依次进行加热固定和有机溶剂固定，然后进行等离子体处理，得到生物制品；

　　优选地，步骤(d)中，等离子体处理时所采用的气体包括空气、氧气或氩气中的任意一种或几种的组合；

　　优选地，步骤(d)中，等离子体处理时的时间为0.5-10min，功率为20-300w。

　　优选地，所述应用包括将所述生物制品进行紫外光杀菌处理，清洗，然后进行细胞培养。

　　(1)本发明提供了一种生物制品的制作方法，通过将微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和任选地水分别注入到培养板的同一培养孔内混合，形成微纳颗粒混合液，然后再将培养板内的微纳颗粒混合液进行干燥，最后对培养孔内排列出的多级微纳结构进行固定，得到生物制品；该制作方法利用颗粒自组装技术在培养板内高通量(快速与大量)的制备出具有不同化学组成和表面拓扑结构的多级微纳米结构，该生物制品实现了培养板与多级微纳结构的稳固结合，为其在生物医药中的应用提供了基础；

　　另外，作为一种典型但非限制性的方式，采用全自动分注系统将不同组合的微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和水注入到培养板内，并在短时间内于培养板上高通量(快速且大量)制备出具有不同化学组成且规格均一的多级微纳表面结构，可实现自动化批量生产，大大节省了人力和时间。

　　(2)本发明提供了一种生物制品，采用上述生物制品的制作方法制得，该生物制品包括培养板和多级微纳结构，培养板上不同表面拓扑结构和化学组成的多级微纳结构使得该生物制品可适用于细胞生物学研究，并可应用于需要长期细胞培养的研究中。

　　(3)本发明还提供了上述生物制品在细胞培养中的应用，鉴于上述生物制品所具有的优势，使得以该生物制品在细胞黏附、增殖和分化等细胞培养领域具有良好的应用。

　　为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

　　图2为本发明实施例1-24(#1-#24)提供的生物制品表面的多级微纳结构；

　　图3为本发明提供的生物制品上多级微纳结构的sem图，其中a为实施例2(#2)，b为实施例4(#4)，c为实施例8(#8)，d为实施例11(#11)；

　　图4为本发明提供的生物制品多级微纳结构的sem图，其中e为实施例14(#14)，f为实施例18(#18)，g为实施例19(#19)，h为实施例21(#21)；

　　图5为本发明提供的生物制品上多级微纳结构的sem图，其中i为实施例23(#23)，j为实施例25(#25)；

　　图6为本发明提供的生物制品在培养细胞后的多级微纳结构的sem图，其中m为实施例8(#8)，n为实施例25(#25)；

　　图7为将本发明实施例1-24(#1-#24)提供的生物制品用于骨髓间充质干细胞黏附(接种细胞48h后)实验结果图；

　　图8为将本发明实施例1-24(#1-#24)提供的生物制品用于骨髓间充质干细胞黏附(接种细胞48h后)实验后细胞的长宽比；

　　图9为将本发明实施例1-24(#1-#24)提供的生物制品用于骨髓间充质干细胞诱导成骨分化(21天后，茜素红染色矿化结节(红色))实验结果图。

　　下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

　　(b)将微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和任选地水分别注入到培养板的同一培养孔内混合，形成微纳颗粒混合液；

　　(c)将含有微纳颗粒混合液的培养板进行干燥，使培养孔内排列出多级微纳结构；

　　本发明提供的生物制品的制作方法是根据分子自组装原理，采用“由下而上”的制备方法，具体制作原理为：将微米颗粒溶液和有机纳米颗粒溶液混合后，微米颗粒溶液中的微米颗粒和有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒在重力沉降作用下聚集在培养板的培养孔底部，然后各颗粒之间通过静电作用在培养孔内上排布形成多级微纳结构，将多级微纳结构固定于培养孔内，得到培养孔内形成有多级微纳结构的生物制品。

　　具体的，步骤(a)中，微米颗粒溶液是指含有微米颗粒的水溶液，有机纳米颗粒溶液是指含有有机纳米颗粒的水溶液。

　　微米颗粒溶液中的微米颗粒和有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒，其种类以及浓度等参数均不作限定。同时，微米颗粒以及有机纳米颗粒化学组成不限于特定的一种，可以为多种。微米颗粒溶液和有机纳米颗粒溶液的来源也不作限定，可以市购，也可以自行制备。

　　培养板，就是指生物学常用的细胞培养板，对于培养孔的孔数以及培养孔的底部形状不作具体限定。

　　步骤(b)中，“任选地”是指水可以加入也可以不加入，此处不作为必要条件，水的用量可根据微米颗粒溶液和有机纳米颗粒溶液中水的含量进行设定。

　　将微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和任选地水注入到同一培养孔内，这样可实现微米颗粒与有机纳米颗粒的混合。

　　步骤(c)中，干燥的目的是使微纳颗粒混合液中的液体(水)蒸发，从而使得微米颗粒和有机纳米颗粒在培养孔内均匀涂布。鉴于微米颗粒与有机纳米颗粒颗粒尺寸的差异，有机纳米颗粒颗粒可填充在微米颗粒与微米颗粒之间形成的间隙中，即有机纳米颗粒作为微米颗粒的填充物，从而形成多级微纳结构。

　　步骤(d)中，为了防止所形成的多级微纳结构从培养孔底部或内表面脱落，故将多级微纳结构与培养孔进行固定，从而得到培养孔内形成有多级微纳结构的生物制品。

　　本发明提供的该制作方法利用颗粒自组装技术在培养板内高通量的制备出具有不同化学组成和表面拓扑结构的多级微纳米结构，该生物制品实现了培养板与多级微纳结构的结合，为其在生物医药中的应用提供了基础。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(a)中，微米颗粒溶液中的微米颗粒为无机微米颗粒或有机微米颗粒，优选为无机微米颗粒。

　　优选地，无机微米颗粒包括sio2微米颗粒、zno微米颗粒、tio2微米颗粒或mno2微米颗粒中的任意一种或至少两种的组合。

　　优选地，有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒包括聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，pmma)纳米颗粒和/或聚苯乙烯或其衍生物纳米颗粒。

　　通过对微米颗粒和有机纳米颗粒具体种类的限定，可实现多级微纳结构的多样化，从而使得多级微纳结构表面拓扑结构和化学组成更丰富。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(a)中，微米颗粒溶液中微米颗粒的质量分数为5-15％；微米颗粒在微米颗粒溶液中典型但非限制性的质量分数为5％、6％、8％、10％、12％、14％或15％。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(a)中，微米颗粒溶液中微米颗粒的粒径为1-10μm；微米颗粒典型但非限制性的粒径为1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、8μm或10μm。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(a)中，有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的质量分数为5-15％；有机纳米颗粒在有机纳米颗粒溶液中典型但非限制性的质量分数为5％、6％、8％、10％、12％、14％或15％。

　　通过对微米颗粒溶液中微米颗粒质量分数和粒径的限定以及有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒质量分数和粒径的限定，可有效调控多级微纳结构表面的拓扑结构。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(b)中，微米颗粒溶液、纳米颗粒溶液和任选地水分别通过全自动分注系统注入到培养板的同一培养孔内。

　　全自动分注系统，又称全自动数字式分注器，此为现有设备，具体如图1所示。其主要功能为液体制备分装、药物加注、序列稀释、核酸浓度自动调整等。而将其应用于多级微纳结构的制备还尚属首次。

　　采用全自动分注系统将不同组合的微米颗粒溶液KY体育官方网站、有机纳米颗粒溶液和水注入到培养板内，并在短时间内于培养板上快速且大量(高通量)制备出具有不同化学组成且规格均一的多级微纳表面结构，可实现自动化批量生产，大大节省了人力和时间。

　　根据培养板每一培养孔的底面积和微纳米颗粒、有机纳米颗粒的直径及浓度可计算得到每一培养孔内所需加入的微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液的体积。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(b)中，同一培养孔内所需加入的微米颗粒溶液的体积以式1所示计算得到，所需加入的有机纳米颗粒溶液的体积以式2所示计算得到：

　　式1：v1＝a*s/(w1/ρ1/v1)，其中，v1为同一培养孔内所需加入的微米颗粒溶液的体积，a为0.7-0.9，s为培养孔的底面积，w1为微米颗粒溶液中微米颗粒的质量分数，ρ1为微米颗粒溶液中微米颗粒的密度，v1为微米颗粒溶液中单个微米颗粒的体积；

　　式2：v2＝(1-a)*s/(w2/ρ2/v2)，其中，v2为同一培养孔内所需加入的有机纳米颗粒溶液的体积，a为0.7-0.9，s为培养孔的底面积，w2为有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的质量分数，ρ2为有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的密度，v2为有机纳米颗粒溶液中单个有机纳米颗粒的体积。

　　需要说明的是，式1和式2中的“/”表示除以，“*”表示乘以。上述公式可用于各种型号培养板的培养孔中所需要加入的微米颗粒溶液和有机纳米颗粒溶液的体积的计算。

　　作为本发明的一种可选实施方式，当微米颗粒溶液中的微米颗粒为sio2微米颗粒(粒径5μm)，有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒为聚甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒(粒径0.4μm)，且微米颗粒溶液中的微米颗粒的质量分数以及有机纳米颗粒溶液中有机纳米颗粒的质量分数均为10％时，并将上述微米颗粒溶液和有机纳米颗粒溶液注入到24孔培养板的同一培养孔内，根据式1和式2可计算微米颗粒溶液和有机纳米颗粒溶液的体积比，并根据实际需要加水量，确定微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和水的体积比为(5-11):(1-4):(200-500)；

　　通过对微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和水的体积比的具体限定，使得培养孔内可形成比较均匀的多级微纳结构。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(b)中，采用蛋白质溶液和/或聚多巴胺溶液对培养板的培养孔进行表面处理之后，再将微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和任选地水分别注入到所述培养板的同一培养孔内。

　　采用蛋白质溶液聚多巴胺溶液对培养孔进行表面处理，可使得各培养孔的表面处于较为一致的状态，有利于提升多级微纳结构在培养孔内形成(涂布)效果。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(b)中，表面处理包括将蛋白质溶液和/或聚多巴胺溶液加入到培养孔内，室温静置30-60min的步骤；

　　优选地，步骤(b)中，蛋白质溶液包括明胶溶液和/或胶原蛋白溶液，优选为明胶溶液。通过对表面处理具体步骤以及蛋白质溶液浓度和种类的限定，使得对各培养孔表面的处理效果更好。

　　作为本发明的一种可选实施方式KY体育官方网站，步骤(b)中，采用蛋白质溶液或聚多巴胺溶液对所述培养板的培养孔进行表面处理之后，再进行等离子体处理，然后将所述微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和任选地水分别注入到所述培养板的同一培养孔内。

　　对培养孔进行等离子体处理，可以增加培养孔表面的亲水性，有助于颗粒在表面的组装。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(b)中，等离子体处理时所采用的气体包括空气、氧气或氩气中的任意一种或至少两种的组合；

　　通过对等离子体处理时具体工艺参数的限定，使得其对培养孔表面的处理效果更佳。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(c)中，干燥的温度为20-60℃，干燥的时间为12-48hKY体育官方网站。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(d)中，所述固定包括加热固定和有机溶剂固定。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(d)中，将培养孔内的多级微纳结构依次进行加热固定和有机溶剂固定。

　　由于多级微纳结构中的有机纳米颗粒一般位于微米颗粒之间的空隙中，故在加热的条件下，使得至少部分有机纳米颗粒能够熔化，将该多级微纳结构固定于培养孔内表面上。

　　优选地，步骤(d)中，加热固定包括将形成有多级微纳结构的培养板于90-99℃下加热1-24h的步骤；

　　典型但非限制性的加热温度为90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或99℃；典型但非限制性的加热时间为1h、4h、5h、8h、10h、12h、14h、15h、18h、20h、22h或24h。

　　通过对加热固定具体参数的限定，使得有机纳米颗粒能够达到熔化的状态，并将多级微纳结构固定于培养孔内表面上。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(d)中，将加热固定后的多级微纳结构进行有机溶剂固定；

　　优选地，步骤(d)中，有机溶剂固定包括以下步骤：将有机溶剂加入到培养孔中，与加热固定后的多级微纳结构混合1-5s后排出；典型的混合时间为1s、2s、3s、4s或5s。

　　优选地，步骤(d)中，在有机溶剂固定中采用的有机溶剂为甲苯和乙醇的混合溶液，其中，甲苯和乙醇的体积比为1:(0.5-5)，典型但非限制性的甲苯和乙醇的体积比为1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。

　　有机溶剂固定可实现多级微纳结构中相邻的微米颗粒与微米颗粒之间或微米颗粒与纳米颗粒之间的结合(固定)，防止后期微米颗粒和/或纳米颗粒的脱落。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(d)中，将培养孔内的多级微纳结构依次进行加热固定和有机溶剂固定，然后进行等离子体处理，得到生物制品。

　　作为本发明的一种可选实施方式，步骤(d)中，等离子体处理时所采用的气体包括空气、氧气或氩气中的任意一种或几种的组合；

　　通过对等离子体处理时具体工艺参数的限定，使得其对培养孔表面的处理效果更佳。

　　传统在玻璃片基底上制备微纳结构，制备前需要对玻璃片用聚苯乙烯进行预包被，并且需要利用特殊夹具固定玻璃片，操作复杂，需要200℃加热固定，实验危险系数高。本发明提供的生物制品的制作方法是将多级维纳结构直接在不同型号细胞培养板(皿)中即可制备，加热固定温度为90～99℃，制备条件更温和简单，并且不同型号培养盘(皿)与细胞生物学研究中用到的显微镜、酶标仪等仪器匹配度更好；

　　传统在玻璃片基底上制备微纳结构，只能进行短期的细胞培养实验(最长2周)，而本发明提供的生物制品可以多种组合方式用于细胞长期培养实验中。例如，以24孔的生物制品为例，其24孔可以全部含有同一种多级微纳结构，也可以含有不同种类的微纳多级结构，具体可根据实际需求定制，满足不同实验需求。

　　根据本发明的第二个方面，还提供了一种生物制品，采用上述生物制品的制作方法制得。

　　该生物制品包括培养板和多级微纳结构，培养板上具有不同表面拓扑结构和化学组成的多级微纳结构，使得该生物制品更适用于细胞生物学研究，并可应用于需要长期细胞培养的研究中。

　　鉴于上述生物制品所具有的优势，使得以该生物制品在细胞黏附、增殖和分化等细胞培养领域具有良好的应用。

　　作为本发明的一种可选实施方式，杀菌处理为紫外照射杀菌处理，紫外照射时间为0.5-2h；典型但非限制性的紫外照射时间为0.5h、1.0h、1.5h或2.0h。

　　杀菌处理后可采用清洗溶液，例如磷酸缓冲液，进行清洗。经过上述处理后，该生物制品即可应用于细胞培养实验中。

　　本发明提供的生物制品，其多级微纳结构具有不同化学组成和表面拓扑结构，且多级微纳结构与培养板的稳固结合，使得其更适用于细胞生物学研究，可应用于需要长期细胞培养的研究中，并且可根据实验需求筛选可达到实验目的的表面。

　　下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。需要说明的是，全自动分注系统购自鸿洺科技有限公司。

　　(a)提供微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和培养板；其中，微米颗粒溶液中微米颗粒为sio2微米颗粒，微米颗粒的质量分数为10％，有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒为pmma纳米颗粒，有机纳米颗粒的质量分数为10％；培养板为24孔培养板；

　　(b)将sio2微米颗粒溶液、pmma纳米颗粒溶液和水分别注入到全自动分注系统的a取样管、b取样管和c取样管，设置仪器参数为a管每次出液10.28μl，b管每次出液3.46μl，c管每次出液300μl，出液顺序为a→b→c，sio2微米颗粒溶液、pmma纳米颗粒溶液和水注入到培养板的1#培养孔内，将培养板震荡以将上述溶液混合均匀，形成微纳颗粒混合液；

　　(c)将含有微纳颗粒混合液的培养板于30℃恒温干燥箱中进行加热干燥12h，使培养孔内排列出多级微纳结构；

　　(d)将步骤(c)中具有多级微纳结构的培养孔放置于烘箱中，于90℃加热固定12h；

　　对加热固定后的多级微纳结构进行有机溶剂固定，具体将有机溶剂加入到培养孔中，与加热固定后的多级微纳结构混合3s后吸出，所采用的有机溶剂为甲苯和乙醇的混合溶液，甲苯和乙醇的体积比为1:1；

　　上述固定处理后，采用无水乙醇对固定后的培养板进行清洗，清洗次数为3次，然后将清洗后的培养板在通风橱过夜晾干，使残留溶剂充分挥发，得到生物制品。

　　实施例2-24分别提供了生物制品的制作方法，除了所采用的微米溶液中的微米颗粒或有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒的具体种类与直径不同，以及所注入到培养板的培养孔的位置不同(#2-#24培养孔，如图2所示)，其余步骤与实施例1相同。实施例1-24中的颗粒种类与平均粒径参数具体见表1。

　　本实施例提供一种生物制品的制作方法，步骤(d)中对于培养孔内的多级微纳结构只进行了加热固定，未进行有机溶剂固定，其余步骤与实施例8相同。

　　(a)提供微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和培养板；其中，微米颗粒溶液中微米颗粒为tio2微米颗粒，微米颗粒的质量分数为5％，平均粒径为1μm，有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒为ps纳米颗粒，有机纳米颗粒的质量分数为5％，平均粒径为50nm；

　　培养板为12孔培养板，并采用明胶溶液对培养板的培养孔进行表面处理，包括以下步骤：将质量分数为0.1％的明胶溶液加入到培养孔内，室温静置30min后，得到表面处理后的培养板；

　　(b)将tio2微米颗粒溶液、ps纳米颗粒溶液和水分别注入到全自动分注系统的a取样管、b取样管和c取样管，设置仪器参数为a管每次出液6.25μl，b管每次出液1.50μl，c管每次出液300μl，出液顺序为a→b→c，tio2微米颗粒溶液、ps纳米颗粒溶液和水注入到步骤(a)中经表面处理的培养板的1#培养孔内，将培养板震荡以将上述溶液混合均匀，形成微纳颗粒混合液；

　　(c)将含有微纳颗粒混合液的培养板于40℃恒温干燥箱中进行加热干燥12h，使培养孔内排列出多级微纳结构；

　　(d)将步骤(c)中具有多级微纳结构的培养孔放置于烘箱中，于98℃加热固定2h；

　　对加热固定后的多级微纳结构进行有机溶剂固定，具体将有机溶剂加入到培养孔中，与加热固定后的多级微纳结构混合5s后吸出，所采用的有机溶剂为甲苯和乙醇的混合溶液，甲苯和乙醇的体积比为1:2；

　　上述固定处理后，采用无水乙醇对固定后的培养板进行清洗，清洗次数为5次，然后将清洗后的培养板在通风橱过夜晾干，使残留溶剂充分挥发，得到生物制品。

　　(a)提供微米颗粒溶液、有机纳米颗粒溶液和培养板；其中，微米颗粒溶液中微米颗粒为sio2微米颗粒，微米颗粒的质量分数为15％，平均粒径为3.5μm，有机纳米颗粒溶液中的有机纳米颗粒为psc纳米颗粒，有机纳米颗粒的质量分数为15％，平均粒径为80nm；

　　培养板为12孔培养板，并采用聚多巴胺溶液对培养板的培养孔进行表面处理，包括以下步骤：将质量分数为1％的聚多巴胺溶液加入到培养孔内，室温静置60min后，得到表面处理后的培养板；

　　(b)将sio2微米颗粒溶液、psc纳米颗粒溶液和水分别注入到全自动分注系统的a取样管、b取样管和c取样管，设置仪器参数为a管每次出液6.25μl，b管每次出液1.50μl，c管每次出液300μl，出液顺序为a→b→c，sio2微米颗粒溶液、psc纳米颗粒溶液和水注入到步骤(a)中经表面处理的培养板的1#培养孔内，将培养板震荡以将上述溶液混合均匀，形成微纳颗粒混合液；

　　(c)将含有微纳颗粒混合液的培养板于35℃恒温干燥箱中进行加热干燥18h，使培养孔内排列出多级微纳结构；

　　(d)将步骤(c)中具有多级微纳结构的培养孔放置于烘箱中，于95℃加热固定8h；

　　对加热固定后的多级微纳结构进行有机溶剂固定，具体将有机溶剂加入到培养孔中，与加热固定后的多级微纳结构混合2s后吸出，所采用的有机溶剂为甲苯和乙醇的混合溶液，甲苯和乙醇的体积比为1:4；

　　上述固定处理后，采用无水乙醇对固定后的培养板进行清洗，清洗次数为4次，然后将清洗后的培养板在通风橱过夜晾干，使残留溶剂充分挥发，得到生物制品。

　　为检测生物制品表面所形成的多级微纳结构的表面形貌特征，以实施例2(#2)、实施例4(#4)、实施例8(#8)、实施例11(#11)、实施例14(#14)、实施例18(#18)、实施例19(#19)、实施例21(#21)、实施例23(#23)和实施例25(#25)为例对其提供的生物制品表面的多级微纳结构进行sem测试，具体结果见图3-图5。

　　由图3、图4和图5可以看出，采用不同粒径的微米颗粒或有机纳米颗粒的组合，其表面形貌中微米颗粒基本上呈六边形分布，并且不同组合其六边形的边长不同。

　　同时，以实施例8和实施例25为例，对培养细胞后的生物制品的多级微纳结构进行sem测试，具体如图6所示。图6中的图m#8和图n#25分别为实施例8、实施例25提供的生物制品在进行细胞培养后的多级微纳结构sem图。需要说明的是，实施例25为实施例8的对照实验，与实施例8相比，实施例25生物制品的制作方法中步骤(d)对于培养孔内的多级微纳结构只进行了加热固定，未进行有机溶剂固定。由图6中图m#8中可以看出，细胞培养后实施例8生物制品表面的多级微纳结构与细胞培养前生物制品表面的多级微纳结构(图3c#8)基本无变化，而由图6中图n#25中可以看出，细胞培养后实施例25生物制品表面的多级微纳结构中的微米颗粒和纳米颗粒均有不同程度的脱落，这也说明在生物制品制作过程中将多级微纳结构固定于培养孔内最好采用加热固定和有机溶剂固定两种方式相结合。

　　在将各实施例提供的生物制品应用于细胞培养中之前，对各生物制品进行紫外照射杀菌处理，紫外照射时间为1h，杀菌处理后，再采用磷酸缓冲液对其进行清洗，然后将该生物制品应用于细胞培养实验。

　　具体的，将骨髓间充质干细胞在实施例1-24(培养孔#1-#24)提供的生物制品上进行黏附和分化实验。从图7和图8中可以看出，接种细胞48小时后，骨髓间充质干细胞在不同表面的黏附状态不同，与传统细胞培养(tcp，即采用普通细胞培养板)表面相比，细胞的长宽比明显变小，说明实例1-24提供的生物制品能够调控细胞形态。

　　将实施例1-24(#1-#24)提供的生物制品用于骨髓间充质干细胞诱导成骨分化，其中，tcp-pc代表阳性对照组(采用普通细胞培养板进行培养，且培养基中有添加成骨分化诱导因子)，tcp-nc代表阴性对照组(采用普通细胞培养板进行培养，培养基中无添加成骨分化诱导因子)。从图9的诱导成骨分化实验结果可以看出，经21天细胞培养后，多级微纳结构在生物制品上稳定存在，并且细胞分化结果有差异，说明生物制品表面的不同多级微纳结构对细胞的刺激不同，可调控细胞的分化特性。

　　综上，本发明提供的生物制品，其具有不同化学组成和表面拓扑结构的多级微纳结构，适用于细胞生物学研究，可应用于需要长期细胞培养的研究中，并且可根据实验需求筛选可达到实验目的的表面。

　　最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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